AAT Bioquest活細胞鈣成像新利器——Calbryte 520, AM在動態監測中的核心優勢與應用解析

AAT Bioquest新型鈣離子熒光探針Calbryte 520, AM是一種高性能的熒光染料，廣泛應用于活細胞鈣離子（Ca2?）動態變化的實時監測。以下是其應用領域及核心優勢的詳細分析：

一、主要應用領域

活細胞鈣成像

神經元活動研究：監測動作電位或神經遞質釋放觸發的鈣瞬變，適用于腦片或原代神經元。

心肌細胞研究：分析心肌收縮過程中的鈣振蕩及信號傳導。

多參數熒光聯用

兼容GFP/RFP等熒光蛋白或其他探針（如線粒體染料），支持多色成像。

長期動態追蹤

適用于數小時的長時間鈣信號記錄（如晝夜節律相關研究）。

二、核心優勢

光穩定性與信噪比

相比傳統探針（如Fluo-4），Calbryte 520的熒光強度更高，光漂白速率更低，適合長時間或高分辨率成像（如共聚焦、雙光子顯微鏡）。

更高的鈣親和力與靈敏度

Kd ~320 nM，在低鈣濃度下仍能清晰響應，可檢測微小的鈣波動（如亞細胞器鈣釋放）。

優異的細胞滲透性與負載效率

乙酰氧甲酯（AM）形式：無需顯微注射，溫和穿透細胞膜，且胞內酯酶水解效率高，適合難轉染細胞（如原代細胞、干細胞）。

低細胞毒性

長時間孵育（如>2小時）對細胞活性影響較小，減少實驗干擾。

兼容性廣泛

激發/發射波長（Ex/Em: 490/520 nm）適配常規FITC濾光片系統，與流式細胞儀、微孔板讀數儀等設備匹配。

pH不敏感性

在生理pH范圍內（6.5-8.0）熒光信號穩定，避免因代謝酸化導致的假陽性。

三、使用注意事項

負載條件優化：建議使用含Pluronic F-127的緩沖液（如HBSS）增強疏水性AM酯的溶解性。

校準建議：需結合鈣離子載體（如ionomycin）和EGTA進行原位校準，以定量**鈣濃度。

多色實驗設計：需注意與其他探針的光譜重疊（如綠色通道），建議通過線性 unmixing 校正。

四、對比傳統探針(如Fluo-4, Rhod-2)

Calbryte 520, AM憑借其高靈敏度、低毒性及廣泛的兼容性，成為復雜鈣信號研究（如神經科學、藥理學）的理想工具，尤其在需要長時間或高時空分辨率成像的實驗設計中優勢顯著。

圖1.Calbryte 520 AM（# 20653）和 Fluo-4, AM（# 20550）在 CHO-K1 細胞中測量了 ATP 反應。CHO-K1 細胞以每孔 50,000 個細胞/100 μl的密度在 96 孔黑色壁/透明底 Costar 板中過夜培養。向孔中加入 100 μl 10 μg/ml Calbryte 520 AM 或 10  μg/ml Fluo-4， AM 的 HH 緩沖液，在 37°C 下孵育 45 分鐘。移除兩種染料加載溶液，每孔加入 200 μl HH 緩沖液。每孔加入 50 μl ATP，以達到濃度為 10 μM。在 Keyence 顯微鏡的 FITC 通道中獲取圖像。

圖2.通過激光掃描共聚焦顯微鏡分析了細胞內游離鈣離子的分布情況。細胞內游離鈣離子通過紅色熒光探針Rhod-2 AM（#21060）進行檢測。細胞核用 DAPI（藍色）染色。攜帶 eGFP 報告基因的 pEZ-LV203 載體產生綠色熒光蛋白。